Нитрификация.

[Шура]

Бактерий-нитрификаторов можно назвать одними из самых удивительных живых существ на Земле. Для жизни им необходимы только минеральные вещества. Такие формы жизни биологи называют хемоавтотрофными, они встречаются лишь у некоторых бактерий, в нашем случае – нитрификаторов. Для пластического обмена (роста и развития) они используют воду, углекислый газ и аммоний. Энергию и восстановители для пластического обмена они добывают только в результате кислородного окисления аммиака и нитритов. Энергетический выигрыш этих реакций невелик, поэтому для роста и развития бактерии-нитрификаторы вынуждены «перелопачивать» огромное количество аммонийного и нитритного азота. Понятно, что желающих вести столь аскетичный образ жизни, весьма немного. В отличие от довольно многочисленных аммонификаторов, бактерии-нитрификаторы выделены лишь в одно семейство Nitrobacteraceae, насчитывающее всего 8 родов. Их можно разделить на две группы: группу родов (5 из 8), представители которой окисляют аммиак до нитритов (первая фаза нитрификации) и группу родов, представители которой окисляют нитриты до нитратов (вторая фаза нитрификации). Это «разделение труда» отражено и в их названиях. Название родов бактерий первой фазы нитрификации начинается с Nitroso-: Nitrosоmonas, Nitrosospira, второй - с Nitro-: Nitrobacter, Nitrococcus. Честь открытия хемоавтотрофной формы жизни принадлежит нашему соотечественнику, русскому микробиологу С. Н. Виноградскому. Именно он в 1890 г. блестяще доказал способность бактерий- нитрификаторов расти только на минеральных субстратах. Он же доказал, что органические вещества способны подавлять рост этих микроорганизмов.

В аквариумистике сопряженную работу двух звеньев азотного цикла – аммонификации и нитрификации принято называть биологической фильтрацией. Для ее нормального функционирования в условиях аквариума, необходимы насыщенная кислородом вода и подходящий субстрат для поселения бактерий.

Бактерии-нитрификаторы входят либо в состав перифитона, либо являются компонентами ила. Представители первой фазы нитрификации развиваются как правило в перифитоне совместно с бактериями-аммонификаторами. Поэтому в сбалансированном аквариуме образующийся аммиак «съедается» на месте возникновения, и поэтому появление в воде аммонийного азота часто бывает связано с развитием планктонных аммонификаторов. Ввиду невысокой скорости метаболических процессов у бактерий-нитрификаторов по сравнению с аммонификаторами, их численность начинает стабилизироваться лишь на третьей неделе со дня зарядки аквариума. Это выражается в исчезновении из воды нитритов – опасного промежуточного продукта нитрификации. Лишь после этого аквариум становится пригодным для заселения.

В отличие от аммонификации, сбой работы нитрифицирующего звена азотного цикла в условиях аквариума встречается реже, но это пожалуй самая грустная ситуация. Дело в том, что длительность стабилизации необходимой численности бактерий-нитрификаторов напрямую связана с эффективностью их энергетического обмена. У бактерий второй фазы нитрификации эффективность энергетического обмена втрое ниже, чем у бактерий первой фазы. Поэтому, если появившийся в воде аквариума аммоний перерабатывается за 3, максимум - 5 дней, то бактерии второй фазы нитрификации перерабатывают образовавшийся нитрит в нитрат соответственно за 9-15 дней. Столь продолжительный контакт с ядом способны выдержать далеко не все обитатели аквариума. Коварство нитритов заключается еще и в том, что внешние проявления вроде помутнения воды, отсутствуют. Нитриты можно обнаружить только аналитически, используя соответствующие гидрохимические тесты. Об этом уже писал на страницах журнала «Аквариум» И. И. Ванюшин. Сюда же следует добавить и повышенную чувствительность бактерий второй фазы нитрификации к органическим веществам (сильно заиленные биофильтры, грязные поролоновые губки для механической фильтрации) и многим антибиотикам. Надежных технических помощников, убирающих нитриты, пока не изобрели. Массированные подмены воды, в отличие от ситуации с аммонийным азотом, совершенно бесполезны. При наличии в хозяйстве нескольких аквариумов, можно воспользоваться «мобильными» биофильтрами, работающими под нагрузкой в других аквариумах, или «рабочими» поролоновыми губками из стабильных аквариумов. По наблюдениям, в этом случае для исправления ситуации достаточно 3-5 дней.

Подобные нарушения могут возникать и в ситуациях, когда в аквариум залпово сажается большое количество рыб, особенно если их необходимо усиленно кормить. Биологическая система очистки не может быстро справиться с резко возросшей нагрузкой и в воде появляются токсичные азотистые соединения. Причем с аммонийной нагрузкой аквариум справляется достаточно быстро, а нитритный азот удерживается заявленных 1,5-2 недели, обесценивая труд аквариумиста. Как уже отмечалось, надежных внешних проявлений присутствия нитритов в воде аквариума нет, так же как и нет специфических внешних симптомов, по которым можно установить нитритное отравление у рыб. Диагноз можно поставить только на основании результатов гидрохимических анализов, благо необходимые для этого тесты на рынке зоотоваров представлены достаточно широко.

[Шура]

Аммиак (NH3) способен активно взаимодействовать с водой:

NH3 + H2O - (NH4OH) - NH4+ + OH-. В результате в воде он содержится в двух формах:

- ионизированный аммонийный азот (ион аммония, NH4+)

- неионизированный аммонийный азот (собственно аммиак, NH3).

Применяемые в аквариумистике и рыбоводстве тесты не различают ионизированную и

неионизированную формы аммиака и определяют его суммарное, общее количество (NH3+NH4+; NH4+/NH3), которое называют общим аммонийным азотом. Аммоний, ионизированный аммонийный азот, является малотоксичным веществом, тогда как аммиак, неионизированный аммонийный азот, – остро токсичное соединение уже в концентрации 0,02-0,05 мг\л. Зная содержание общего аммонийного азота можно рассчитать концентрацию неионизированного аммония по формуле: NH3 = n\10рК-рН мг\л, где n – содержание общего аммонийного азота в мг\л, определенное с помощью теста; рК (по аналогии с рН) – отрицательный логарифм константы равновесия приведенного выше химического уравнения: рК = -lgК = -lg10-9,3 ? 9,5 = cоnst. Тогда NН3 ? n\109,5-рНмг\л. Например, при содержании общего аммонийного азота 3 мг\л и рН 7,5, содержание токсичного неионизированного аммония NH3 ? 3\109,5-7,5 = 3\102 = 3\100 = 0,03 мг\л будет небезопасным для рыб и потребует хотя бы внеочередной подмены воды. Из уравнения видна прямая зависимость от величины показателя рН доли неионизированного аммония в общем аммонийном азоте: с увеличением рН на одну единицу она возрастает в 10 раз и наоборот, с уменьшением рН на 1 единицу – уменьшается в 10 раз. При одинаковом количестве общего аммонийного азота, в кислых водах содержание опасного неионизированного аммония гораздо меньше, чем в щелочных. При нейтральных, физиологических значениях показателя рН воды (рН 7±0,5), аммонийный азот преимущественно ионизирован, т.е. представлен в форме малотоксичных ионов аммония, NН4+. Кроме рН, токсичность аммонийного азота зависит от его концентрации, длительности экспозиции и ее повторности, насыщения воды кислородом и др.

Источником, поставщиком аммонийного азота в аквариуме являются бактерии аммонифицирующего звена азотного цикла и сами рыбы. У костистых рыб (Teleostei) основным конечным продуктом азотного обмена (обмена белков и нуклеиновых кислот), подлежащим выведению из организма, является аммоний и в гораздо меньшей степени мочевина. Таких животных называют аммонотелическими. Кроме рыб аммотеликами являются, например, ракообразные, некоторые водные моллюски. Образуется аммоний преимущественно в результате внутриклеточных превращений аминокислот (процессы дезаминирования и переаминирования). Поскольку аммиак является высокотоксичным продуктом жизнедеятельности, в норме во внутренней среде живых организмов он подлежит немедленной нейтрализации на месте своего возникновения. Эту задачу выполняют глутаминовая аминокислота и некоторые кислоты цикла Кребса - основного производителя АТФ и потребителя кислорода в организме. Физиологической формой аммиака в живых тканях является глутамин – соединение аммиака с глутаминовой аминокислотой. В форме глутамина аммиак транспортируется к месту выделения. У рыб – это жабры. В т.н. хлоридных клетках жаберного эпителия, благодаря работе фермента глутаминазы, глутамин расщепляется до аммония и глутаминовой кислоты. Далее, аммоний активно удаляется хлоридными клетками в обмен на Na+, а челнок-транспортер глутаминовая кислота вновь поступает в кровоток за следующей «порцией» аммиака.

Количество выделяемого рыбами аммония зависит не только от интенсивности их метаболизма, но и от состояния самих животных. Так, при длительном (более часа) стрессе, организм рыб переключает свой энергетический обмен с расхода глюкозы гликогена (т.н. глюкогенез), на расход аминокислот белков тела, в первую очередь белков плазмы крови (т.н. глюконеогенез). В таком состоянии выделение рыбами аммиака резко возрастает. Это явление наблюдается, например, при транспортировке рыб. От аммиачного отравления в этом случае спасает углекислый газ, который подкисляет воду, а в слабокислой среде аммонийный азот представлен малотоксичной ионизированной формой.

Собственно аммиак (неионизированный аммоний, NH3) является весьма реакционноспособным веществом и очень сильным клеточным и тканевым ядом. Свободный аммиак взаимодействует с клеточными белками, вызывая их денатурацию и, соответственно, утерю функции. Связывая при избыточном образовании (глюконеогенез) некоторые кислоты - субстраты цикла Кребса, он блокирует работу последнего, в итоге нарушается клеточное и тканевое дыхание. В живом организме образование аммиака тесно связано с метаболизмом аминокислот, поэтому мишенями аммиачного отравления оказываются органы, активно перерабатывающие аминокислоты и выводящие аммиак из организма. У рыб это в первую очередь: жабры; центральная нервная система (ЦНС), где аминокислоты потребляются для синтеза веществ, проводящих нервный импульс (адреналин, гистамин и др.) и печень, в которой происходит биосинтез многих белков (например, белков плазмы крови, желточных белков икры и др.). Поэтому симптомы аммиачного отравления связаны с расстройством деятельности ЦНС, дыхания, сосудистыми нарушениями.

Клиническая картина отравления зависит от концентрации яда и длительности экспозиции. При остром аммиачном отравлении преобладает нарушение деятельности ЦНС и другие симптомы просто не успевают развиться. Рыбы сильно возбуждены и очень пугливы. Затем развивается нарушение координации движений, судороги и смерть. При хроническом отравлении страдают прежде всего жабры (т.н. неинфекционный экзогенный жаберный некроз). Аммоний, содержащийся в воде, выводит из строя (NH4+-Na+)-насосы хлоридных клеток жаберного эпителия (т.н. «подпорный эффект»), что приводит к гибели последних, самоотравлению, развитию локальных некрозов и гемолизу эритроцитов в жабрах. В результате происходит нарушение дыхания, которое вызывает гибель рыбы от асфиксии при нормальном содержании кислорода в воде. Жабры приобретают мозаичную окраску со светлыми некротическими пятнами.

Сосудистые нарушения связаны с особенностями строения системы кровообращения рыб, как животных с одним кругом кровообращения. Кровоток у них минимален в органах, наиболее удаленных от сердца, например в хвостовом плавнике. Действуя сосудосуживающе, аммиак лишает эти ткани кислорода и питания, что приводит к локальным некрозам. Многим аквариумистам известен т.н. «краевой ожог» хвостового плавника, встречающийся при транспортировке рыб. Считается, что и острое и хроническое аммиачные отравления развиваются не вследствие прямого воздействия аммонийного азота на рыб, а вследствие остановки работы цикла Кребса (нарушение клеточного дыхания) и нарушения превращений аминокислот (расстройства деятельности ЦНС) из-за исчерпания пула физиологических внутриклеточных поглотителей аммония – глутаминовой и других кислот.

Нередко подобные явления возникают и при нарушении слизеоотделения, особенно в жаберном эпителии. Густая и вязкая слизь, покрывающая жабры, нарушает не только процессы газообмена, но и процессы выделения аммония, что приводит и к гипоксии и к аммиачному самоотравлению. Но рассмотрение таких избыточных физиологических реакций уже отдельная тема. После аммиака наименее желательная форма азота в воде аквариума – нитритная.

[Шура]

Источником нитритного азота (нитрит-иона, NO2-) в воде аквариума, в отличие от азота аммонийного, являются только бактерии, преимущественно нитрификаторы; т.е. источник нитритного азота для организма рыбы всегда внешний, экзогенный. Нитриты не являются ядами контактного действия, поэтому для того, чтобы проявить свои токсические свойства, они должны попасть из внешней среды - аквариумной воды, во внутреннюю среду организма рыбы – кровь. Совершить этот переход путем диффузии невозможно, поскольку биологические мембраны не проницаемы для ионов минеральных веществ. Не составляют исключения ионы Na+ и хлора Cl-, которые поглощаются из воды в кровь хлоридными клетками жаберного эпителия пресноводных рыб в процессах осморегуляции только активно, т.е. с затратой АТФ, против градиента концентрации. Есть основания считать, что ионные насосы, перемещающие через мембрану Cl-, ошибаются в присутствии нитритов и вместо хлорид-ионов перемещают нитриты. Во-первых, подобные ошибки известны и для Na+-насосов; во-вторых, заряд и размер нитрит-ионов допускают такую возможность. В-третьих, для морских рыб, у которых Na+- и Cl--насосы работают в противоположном направлении (т.е. откачивают их из организма в среду), острое нитритное отравление неизвестно.

Во внутренней среде организма рыб мишенью нитритов является система крови. Нитриты относятся к ядам – метгемоглобинобразователям, т.е. окисляют железо гемоглобина, превращая его в метгемоглобин, лишенный способности переносить кислород. Метгемоглобин, в отличие от гемоглобина, обладает темно-вишневым, или шоколадным цветом, что должно быть заметно при рассмотрении жабр отравленных нитритами рыб. Однако на практике, шоколадные (вишневые) жабры встречаются не часто, даже при значительных концентрациях нитритов (5 мг\л и более), поэтому следует искать другие механизмы их токсического действия. Основываясь на фармакологических свойствах нитритов, можно предположить, что, оказавшись в крови, нитриты оказывают мощное сосудорасширяющее действие, ведущее к системному нарушению кровообращения. В этом случае падение кровяного давления и недостаточный венозный возврат крови к сердцу приводят к его остановке и смерти. Рыбы погибают с открытым ртом и плотно прижатыми жаберными крышками, но это характерно и для других отравлений. У золотых рыбок иногда наблюдается гиперемия плавников, у скалярий – ослизнение густой мутной слизью, у живородок – склеивание плавников и ослизнение. Но чаще рыбы просто становятся вялыми и гибнут без каких-либо внешних признаков. В качестве противоядия можно порекомендовать низкие дозы метиленового синего, восстанавливающего метгемоглобин до гемоглобина. Но в целом, пока не восстановится работоспособность биофильтра и нитриты не исчезнут из воды, терапия малоэффективна.

Близкие по свойствам нитраты - конечные продукты нитрификации, в концентрациях, встречающихся в аквариумах (до 400 мг\л) выраженными токсическими свойствами не обладают. По некоторым сообщениям прямые токсичные концентрации нитратов для водных животных вообще неизвестны. Размер нитрат-ионов, в отличие от нитритов, превышает размер хлорид-ионов, поэтому целостные наружные покровы рыб непроницаемы для нитратов. Но при нарушении целостности покровов, вызванной, например, паразитарными заболеваниями и такими терапевтическими мероприятиями как окислительные ванны, нитраты могут оказаться во внутренней среде организма рыб и нанести ущерб (см. В. Ковалев, «Аквариум», №1, 2006). Считается, что во внутренней среде организма нитраты восстанавливаются до нитритов и далее проявляют описанное выше токсическое действие. Физиологические и фармакологические свойства нитратов близки к таковым нитритов и также не имеют специфически выраженных клинических признаков. Но, в общем, в аквариуме со здоровыми рыбами, рассматривать нитраты как токсикологический фактор, оснований нет; это – гигиеническая проблема. Cдерживать рост содержания нитратов могут помочь регулярные подмены воды, а также препараты длительного действия Tetra Aqua Nitrat Minus. Рассмотрение работы денитрофицирущего звена азотного цикла выходит за рамки данной работы.


Подытоживая вышесказанное, можно сделать вывод: нарушение биологического равновесия весьма небезопасно для обитателей аквариума. Однако, несмотря на всю сложность рассматриваемых процессов, аквариумистика смогла выработать очень простые, эффективные и всем известные методы его поддержания: пунктуально проводя текущие мероприятия в аквариуме, лучше ограничиваться минимальным вмешательством, и при еженедельной подмене 20 – 30 % воды и промывке губок механической фильтрации, промывать биофильтр не чаще двух раз в год. А при непонятном ухудшении состояния обитателей аквариума прежде, чем браться за пузырек с лекарством, лучше провести гидрохимический анализ тех параметров воды, которые могут оказывать токсическое действие на рыб: содержание общего аммонийного,

NH4+ + NH3 и нитритного, NO2- азота, углекислого газа ,CO2 ( не более 10 мг\л) и карбонатной «жесткости», dKH (не менее половины от ее значения в водопроводной воде).

[Шура]

Растворенные в воде органические вещества служат питательным субстратом для очень большой группы организмов-гетеротрофов, преимущественно бактерий и грибов. Гетеротрофная форма жизни основана на метаболизме живыми существами только готовых органических соединений, ранее синтезированных другими живыми организмами. Усвоенные ими органические вещества используются по двум направлениям: для роста и развития (пластический обмен, ассимиляция) и для получения энергии (энергетический обмен). В последнем случае, например у аминокислот, отщепляется аминогруппа в форме аммиака, NH3 (дезаминирование), а образовавшаяся органическая кислота после подготовительных превращений «сгорает» в энергетической «топке». В результате образуется АТФ и выделяются: NH3, СО2 и H2O. Способностью к дезамированию обладает любая живая клетка, поэтому группа микророрганизмов-аммонификаторов весьма многочисленна. Эти микроорганизмы используют для своих нужд не только белки, но и широкий круг органических веществ, обеспечивая их минерализацию, благодаря чему играют очень большую роль в поддержании биологического равновесия в аквариуме.

Органические вещества всегда присутствуют в воде, грунте и декорациях даже свеже заряженного аквариума. Любопытно, что микробиологические исследования, проведенные в 80-х годах по получению воды, в которой бактерии не выживали бы из-за недостатка органического углерода, закончились отрицательным результатом. Всеядность аммонифицирующих гетеротрофов при обилии питательного субстрата в аквариуме приводит к их активному размножению в толще воды, что внешне выражается в ее помутнении. Такие планктонные аммонификаторы требуют для своего развития гораздо больших концентраций органических веществ, чем прикрепленные формы. По мере «выедания» органических веществ, численность планктонных форм снижается, и их функции принимают на себя «сидячие» формы (компоненты перифитона). С одной стороны, это сопровождается просветлением воды аквариума, с другой – сопряжено с появлением в аквариумной воде аналитически обнаруживаемых количеств аммонийного азота. Примерно так выглядит ситуация к концу первой недели со дня зарядки аквариума.

Сходные процессы происходят и в старом аквариуме при залповой посадке большого количества рыб, или при нарушении биологического равновесия, когда количество растворенных органических веществ превышает потребности в них популяции перифитонных аммонификаторов. Это приводит к вспышке планктонной микрофлоры (помутнение воды) и появлению в воде опасных количеств аммонийного азота. Как правило, такое бывает при перекорме рыб, или отказе их от корма. Если не съеденные остатки вовремя не удалить, то происходит нарушение биологического равновесия, или биологическое загрязнение аквариума. Причем, чем плотнее заселен аквариум, тем тяжелее последствия биологического загрязнения. При незначительном нарушении биологического равновесия (у рыб отсутствуют признаки гипоксии, содержание общего аммонийного азота менее 2 мг\л), ситуация нормализуется сама за пару дней. При более сильном биологическом загрязнении, когда вода не восстанавливает свою прозрачность более чем за три дня, рекомендуется заменить до одной трети воды, установить в фильтр активированный уголь. При более длительном биологическом загрязнении, особенно при появлении в воде простейших (инфузорий, жгутиконосцев), или «цветении» воды, очень надежным помощником станет УФ-стерилизатор.

В свежем аквариуме со сменой планктонных гетеротрофов-аммонификаторов перифитонными, «выеданием» растворенных органических веществ и накоплением аммонийного азота связано появление представителей следующего звена азотного цикла – нитрификаторов.